原木灵芝孢子研究：
摘要 扫描电镜观察表明，破壁前灵芝孢子形态完整，破壁后孢壁结构被破坏，通过透射电镜发现破壁孢子的孢内物质易被释放，观察结果表明，复合力场超微粉碎法的破壁率高，超声波—冻融破壁法的破壁效果也较好，而超声速超微气流粉碎法仅使大部分孢子变形，未破坏其孢壁结构。分析结果表明，破壁孢子粉（破壁率≥95%）的粗蛋白、总糖含量变化不大，但粗脂肪（6.35%）及水溶性多糖（2.18%）含量分别较未破壁的提高了38.95%和20.83%；锌、铜、铬、硒等微量元素的含量变化不大，但锰（20μg/g）和镍（5.2μg/g）的含量明显高于未被破壁孢子。此外，包括牛磺酸在内的19种游离氨基酸含量也没有明显变化。
关键词 灵芝孢子粉；破壁；显微形态；化学成分；多糖 ；灵芝孢子的神奇功效
为了获得较理想的破壁效果，本研究曾提取分析了原木灵芝孢子的孢壁成分，结果表明，其主要成分为几丁质（52.08%—57.64%）和粗纤维（2.36%—3.52%）。并采取X-rayEDS及ICP、AAS等方法分析了其元素构成，结果表明，灵芝孢子中无机元素硅（9.2μg/g）、钙（713μg/g）主要存在于孢壁上，导致灵芝孢壁坚韧。结构复杂、坚硬且耐酸碱的孢壁，影响了孢子内含物的释放，使得人体不能有效地吸收利用孢壁的有效成分，因此，进行破壁处理是必要的。
1 材料与方法
1.1 供试材料
收集原木栽培的新鲜“赤芝6号”孢子粉，烘干、过筛（100目）后备用。
1.2 孢子破壁处理
1.2.1 超声速超微气流粉碎法 采用CP-20型超音速超微气流粉碎法分级机（四川空气动力技术开发中心），用于花粉等微粒的破壁粉碎。
1.2.2 超声—冻融破壁法 采用CPS-2型超声波粉碎机（上海超声波仪器厂）或DE-6P3C型超声波细胞破碎机（宁波科生仪器厂）预处理，然后进行冻融、冻干，适于实验方式的破壁及提取。
1.2.3 复合场超细粉碎法 采用新型的***超细化加工机组（华东超细粉体研究中心），适于孢壁坚硬且具韧性的灵芝孢子的破壁粉碎。
1.3 显微形态观察
取破壁率较高（≥95%）的孢子样品，采用HITACHI S-570型扫描电镜观察比较孢子破壁前后的显微形态；另取少许样品分散在2%锇酸中，简单负染处理5min后用铜网载样并挥杆，采用JEM-100CZⅡ型透射电镜观察孢子的破壁形态。
1.4 化学成分分析
一般化学成分及水溶性多糖的测试分析同文献 陈体强，李开本，朱培根等 原木灵芝孢子研究（Ⅲ）与袋栽灵芝孢子的比较，食用菌学报，1998，5（1）；57-60；微量元素及游离氨基酸的测试分析同文献 陈体强，李开本，朱培根等 灵芝孢子粉氨基酸、脂肪酸及元素组成的研究 菌物系统，1997，16（1）；52-56
2 结果与分析
2.1 破壁前后孢子显微形态的变化
在扫描电镜下观察到，未被破壁处理的孢子显微形态完整，而破壁孢子无一定形态，且孢壁超微结构已破坏；通过透射电镜还观察到破壁孢子的孢内物质易被释放。
在扫描电镜下还观察到，超声速超微气流粉碎法的破壁效果不理想（破壁程度较低），大部分孢子仅发生变形与孢壁结构大多未受到破坏；而超声波—冻融破壁法的破壁效果理想（破壁程度高），基本上观察不到完整的孢子形态；此外，复合力场(高速冲击挤压、剪切、研磨等)超细粉碎法的破壁效果也比较理想，孢壁结构基本已解体，形态破碎。
2.2 破壁前后孢子化学成分的差异
分析结果表明，破壁前后孢子的粗蛋白（16.2%，15.3%）和总糖（13.2%，14.9%）含量变化不大；而破壁孢子粗脂肪及水溶性多糖含量变化显著，其测定值达6.35%和5.80%（表1），分别较未破壁孢子提高38.95%和20.83%。测定结果还表明，破壁孢子中锌、铜、镉、硒等微量元素的含量变化不大，但锰（20μg/g）和铬（5.2μg/g）的含量较未破壁前孢子高出许多（表2）；另外，包括牛磺酸在内的19种游离氨基酸含量也没有显著的变化（表3）。据报道（杨新林等，1997），灵芝孢子破壁后化学成分更易提取，其中还原糖（0.37%）、多肽（2.35%）含量明显高于未被破壁孢子粉（分别为0.20%和1.76%）。已知灵芝孢子的多糖成分与其抑制肿瘤、调节**功能等活性有关。
表1 灵芝孢子破壁前后一般化学成分及多糖含量比较
样品 水分 粗蛋白 粗脂肪 总 糖 水溶性多糖
未破壁孢子 8.39 15.3 6.35 14.9 1.81
破壁孢子 8.92 16.2 4.57 13.2 2.18
表2 灵芝孢子破壁前后几种微量元素含量比较
元素 锌 铜 锰 镍 铬 硒
未破壁孢子 52 15 7.8 1.8 20 0.08
破壁孢子 47 29 29 5.2 25 0.06
表3 灵芝孢子破壁前后游离氨基酸含量比较
氨基酸 未破壁孢子 破壁孢子 氨基酸 未破壁孢子 破壁孢子
天冬氨酸Asp 5.694 5.638 异亮氨酸 Tle 0.811 1.570
苏氨酸Thr 1.400 0.602 亮氨酸 Leu 1.679 2.778
丝氨酸Ser 0.581 0.628 酪氨酸 Tyr 0.997 1.750
谷氨酸Glu 2.354 1.724 苯丙氨酸 Phe 1.212 1.877
脯氨酸Pro <0.005 <0.005 赖氨酸 Lys 5.777 3.198
甘氨酸Gly 0.417 0.168 色氨酸 Trp 0.932 1.453
丙氨酸Ala 7.290 3.847 组氨酸 His 0.92 1.041
胱氨酸Cys 1.761 2.496 精氨酸 Arg 27.282 26.450
缬氨酸Val 5.017 4.155 牛磺酸 Tauine 0.091 0.113
3 讨论
3.1 灵芝孢子粉、花粉及其破壁方法的比较
植物的花粉是花粉的雄性孢子。市场上供应的食用花粉是蜜源花粉（又称蜂花粉）、花和孢子粉同是珍贵的天然的孢粉食品。蜂花粉具有抑制肿瘤、增强**力、抗糖尿病、抗**、抗放射等功效；而灵芝孢子粉（提取物）具有影响**系统及防治实实验性糖尿病等多种药理作用。花粉壁主要由孢粉素纤维素等组成，坚硬且耐酸碱；而灵芝孢子的孢壁主要由几丁质、纤维素等组成，坚硬、耐酸碱且有韧性；两者结构特性是很相似的。实际上，灵芝孢子的破壁技术可以参照（蜂）花粉。
据报道，花粉粒经烘干、粗粉碎和过筛后，进行低温冻融及胶原体磨处理，破壁率可达80-90%，并成为粘稠花粉乳（乳化细度≤2μm）；利用超音速高压气流使花粉粒旋转、相撞击，于低温干燥环境中达到粉碎目的，破壁率可达90%-95%，而且维生素、氨基酸及矿元素等主要营养成分的含量均无明显变化；尚德静等（1996）曾探讨采用灵芝、金针菇、猴菌等食用菌液体培养方法，利用生长代谢过程分泌的胞外酶（纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等）降解花粉壁成分，*终使花粉破壁（破壁率可达60%-80%），这有利于营养物质的释放，其以灵芝的发酵破壁效果*好，包子破壁率高达82.4%。据报道（蒋家新等，1996），灵芝孢酶法破壁须先在75%乙醇中浸泡处理（破壁孢壁的醇溶性物质）3d,再用复合酶（含纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶或蛋白酶等）水解4d，破壁率可达49%-52%。
3.2灵芝孢子的超声波—冻融法破壁实验及其孢壁结构研究
超声波作为一种常见的物理场，具有空化效应、高频振动和超大混合作用。超声波的频率和功率（低强度）达到一定水平时，会激发悬浊液里的包子剧烈震动，从而使孢壁开裂、破碎；合超声波—冻融处理，进一步破坏孢壁结构，释放内含物。虽然超声波破壁法处理（孢子粉）有限，但它在担孢子形态结构研究中非常适于样品处理，而且还可用于孢子粉破壁提取和匀化。
3.3 超声速超微气流粉碎法和复合力场超微粉碎法的比较
超声速超微气流粉碎法（即超音速高压气流对撞法），更多应用在精细化工及粉末冶金中，可进行许多物料的超微化粉碎。超音速高压气流在旋转喷射时可产生制冷的焦尔—汤姆逊效应，具有热敏保护；但由于灵芝孢子的孢壁（含几丁质等主要成分）有弹性，气流对撞的结果只能使孢壁变形或向内塌陷，破壁效果反而不明显。
针对灵芝孢子的孢壁即坚硬且有韧性的特点，复合力场超微粉碎法的优点是非常突出的。物料茎粗碎、细化等预处理后再进行超微粉碎。整个粉碎过程通过一套具有高速冲击、挤压、剪切、研磨等多种作用力组成的复合力场的粉碎机组来实现破壁和超微粉碎的目的。通过破壁处理，提高了孢子的利用价值和生物利用率。目前，除灵芝孢子粉的破壁粉碎外，全核山楂粉、鲜骨粉等食品超细化加工中已经采用复合力场超微粉碎法。
3.4 灵芝孢子粉的化学成分
本研究曾报道，原木灵芝孢子粉中粗蛋白含量为14.26%-17.80%，水溶性多糖为1.44%-1.90%；检出18种氨基酸（总计为7.29-7.71mg/100mg）及微量牛磺酸；含粗脂肪3.57%-4.35%，其脂肪酸构成以油酸（55.2%）、亚油酸（16.5%）及棕榈酸（19.8%）为主；采用高效液相色谱分析了灵芝三萜酸，其含量分别为6.8mg/g,,8.0mg/g和2.2mg/g;；从中间出P、S、Si、K、Na、Ca、Mn、Fe、Zn、Cu、Mn、Se等人体必需的常量及微量元素，并对其中锌（Zn 42.0μg/g）、锰(Mn 11.0μg/g)、铜(Cu 12.8μg/g)、硒(0.15μg/g)等微量元素进行了定量分析。据张能荣等（1996，1997）报道，木屑袋栽灵芝孢子粉含有维生素C(5.60mg/100g)、维生素E(61.98 mg/100g)及胡萝卜素（0.09 mg/100g），多糖含量为751 mg/100g，检出18种氨基酸，总量为7.20g/100g。.陈若芸等（1991）曾报道，从灵芝孢子粉提取物的酸性部分分离到灵芝酸B,B,E。
灵芝孢子粉研究进展
灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属**赤芝和黄芝的总称，具有扶正固本等功效，被《本经》成为上品。近年来，对灵芝属**的化学成分及临床作用的研究颇多，对灵芝的生殖细胞孢子药用价值的研究也逐渐增加。笔者拟综述灵芝孢子的研究近况。
1化学组成
由于灵芝孢子的外部包裹了两层坚韧的外壁，一般的物理化学方法有很难将其打破，因此也就限制了对其化学组成、生物活性成分的认识。*近，一些有效的破壁方法的建立促进了对灵芝孢子中生物活性成分的提取、药用价值的研究。
灵芝孢子的化学成分可分为以下几类：蛋白质和氨基酸类、糖肽类、维生素类、胡萝卜素、甾醇类、三萜类、生物碱类、脂肪酸类、内酯和无机离子等。灵芝孢子蛋白质含量达18%，其中异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸等机体必需氨基酸的含量非常丰富，均高达10克/千克。维生素类主要是维生素E，其含量超过60毫克/100克，另外也含有少量的维生素C。灵芝孢子中富含多糖和寡糖，其中二糖、三糖、四糖分别是194、167和250毫克/100克。从赤芝孢子粉的酸性提取物中分离到了一些三萜类化合物，他们是赤芝孢子酸A、B、C和E。三萜类是灵芝子实体中含量高而且种类颇多的一类有机化合物，其种类超过100种，但在灵芝孢子粉中尚未找到如此多的三萜类物质。由于三萜类是重要的生物活性物质，因此三萜类化合物在灵芝子实体与孢子中的差异暗示了二者可能具有不同的药用价值。
灵芝孢子中的脂肪酸类有二十四烷酸（C）、硬脂酸（C）、棕榈酸（C）、二十二烷酸（C）等。内酯类属五环三萜内酯，有赤芝孢子内酯（ganosporelactone）A和B。生物碱类有胆碱（choline）、甜菜碱（betaine）和硫组氨酸甲基内胺盐。灵芝孢子中的无机元素有钙、磷、铁、镁、钠、、锗、硒等，其中有机锗与人体健康和**的防治有密切的关系。
2 药理作用
2．1 **效应：灵芝孢子粉醇提物的水溶部分在体内能抑制小鼠的迟发型过敏反应和对绵羊细胞的初次抗体应答及鸡红细胞诱导的循环抗体水平，在体外可抑制有丝分裂原刺激小鼠**细胞和人扁桃**细胞的增殖反应。
2．2 对实验性糖尿病的防治作用：采用孢子粉醇提物的水溶物部分对小鼠中由四氧嘧啶引起的糖尿病的诱发诱发有一定的防治作用；该提取物亦能拮抗正常小鼠IP葡萄糖或肾上腺素引起的血糖升高，改善了糖尿病小鼠的葡萄糖耐量。
2.3 **作用：在以小鼠或大鼠为实验材料的研究中发现，体外给动物饲用破壁的孢子粉后，胸腺/体重比显著增加，血清凝集素水平增加，T**细胞转化能力显著增加；腹腔巨噬细胞吞噬能力显著提高并抑制了动物移植性肿瘤的生长，提高了血液中谷光甘肽过氧化物酶活力。动物在饲用孢子粉后所表现高活性**能力可能与孢子粉中丰富的肽多糖和高含量的E有关。*近发现灵芝孢子的醇提物在体外具有直接抑制癌细胞生长作用。灵芝孢子醇提物在1毫克/毫升是对人宫颈癌细胞HELA、人肝癌细胞HEPG2等均具有较强的杀伤能力。
2．4 降低胆固醇作用：大鼠在口服灵芝孢子粉并用高脂饲料后，抑制了血清中总胆固醇含量的升高，灵芝孢子粉降低胆固醇的作用很可能与赤芝孢子内酯有关。
2．5 提高机体耐缺养的能力：研究表明，昆明种小鼠口服破壁孢子粉600ml/(Kg.d),14d 后在无氧环境下存活时间显著延长，说明口服孢子粉能增加抗缺氧能力。推测口服孢子粉能增加血液中红细胞和血红细胞的含量，提高机体的带氧和含氧功能并降低机体耗氧量。
2．6 对神经系统的影响： 孢子粉先用乙醚脱脂后用乙醇回流，得到的提取液浓缩至膏状后制成水剂，称之为“孢醇水”，它能使小鼠自主活动明显减少并可延长小鼠的睡眠 时间。另外，临床用于**内脏多动、精神紧张等**时也取得了较好的效果。
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